液相色谱 (HPLC) 使用技巧：流动相配置

王中泰

液相色谱 (HPLC) 使用技巧：流动相配置

测量添加有机溶剂后流动相的 pH 值

pH 计经过校准，可在水溶液中提供正确的 pH 值读数——您使用的缓冲液就是水溶液。如果在测量 pH 值时添加了有机溶剂，则 pH 值将与未添加有机溶剂前的 pH 值不同。

不过，最重要的一点是要保持一致。如果您总是在添加有机溶剂后测量 pH 值，请确保在方法中说明这一点，以便每个人都采用相同的方法。虽然不是 100% 准确，但至少要保持一致，这可能比精确的 pH 值更重要。

合理的使用缓冲液

缓冲液的作用是控制 pH 值并防止 pH 值发生变化。方法的许多其他环节（如样品基质、空气中的二氧化碳、流动相的水源）都会改变流动相的 pH 值，导致保留、峰形和峰响应的变化。甲酸和反式脂肪酸等不属于缓冲液。

在正确的 pH 值范围内使用缓冲液
每种缓冲液都有 2 个 pH 单位的宽泛范围，在此范围内，缓冲液具有最佳的 pH 稳定性。超出这个范围，缓冲液就不能有效抵抗 pH 值的变化。要么在正确的范围内使用缓冲液，要么选择其范围涵盖所需 pH 值的缓冲液。

向有机相中添加缓冲液

将水相缓冲液倒入有机相很有可能导致缓冲液发生沉淀——在很多情况下，沉淀非常细微，以至于无法察觉。因此，我们可以反过来操作，即将溶于有机相的缓冲液加入水相，这样可以大大降低缓冲液沉淀的风险。

将有机相与水相进行预混合

现代输液泵在混合流动相和在线脱气方面非常有效，但并不是每个最终使用您方法的人都有高质量的泵。

例如，将 950 mL 水相与 50 mL 有机相混合，然后过滤并脱气。这样可以减少 HPLC 之间的差异，降低系统中出现气泡和沉淀的风险。但请注意，在泵上混合的 95:5 与在瓶中预混合的 95:5 的保留时间不同--在预混合时，通常需要多添加几个百分点的有机相。

为缓冲液使用正确的 pH 值调节酸或碱

只能使用形成所使用缓冲液的酸或碱。例如，磷酸钠缓冲液只能用磷酸或氢氧化钠来调节。

在方法中说明缓冲液的全部信息，例如：称取 5 克磷酸钠放入 1000 毫升水中缓冲液的类型（单、双或三相）决定其 pH 缓冲范围。所需的摩尔浓度决定了缓冲液的强度。5 克无水磷酸钠和 5 克一水磷酸钠的缓冲强度不同，会影响保留率。

如果以前的方法在有机相管路中使用了缓冲液，那么缓冲液很有可能会在泵管/泵头中析出。

我早期就是这样做的，结果造成了很大的问题。如有疑问，请将其冲洗掉（例如，水与有机相的比例为 80:20）。

不要想着用尽最后一滴流动相

快下班了，发现流动相好像有点不够了，即在分析最后几个样品的时候，流动相会耗尽。在这种情况下，有可能导致泵和色谱柱干涸。因此不少人会选择将流动相瓶进行倾斜，以提供足够的流动相。但即便如此，我们还需要考虑：流动相还会从表面蒸发，当流动相体积较小时，这将会导致流动相组成发生变化，从而对分析结果产生影响。

选择合适的方式对流动相进行脱气/过滤

这对确保缓冲液全部溶解非常有效，但却是最不有效的脱气方法，而且会迅速加热流动相，导致有机部分蒸发。省去以后的麻烦：花 5 分钟时间对流动相进行真空过滤，即只需一个步骤就能完成脱气和过滤。


不同脱气方式的脱气效率比较

yujiansp

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王中泰

yujiansp 发表于 2026-4-13 17:56
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王中泰

yujiansp 发表于 2026-4-13 17:56
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中年人顾虑太多