LC-MS/MS 分析中如何消除基质效应（二）：基质效应评估

王中泰

LC-MS/MS 分析中如何消除基质效应（二）：基质效应评估

从生物样品中提取分析物后，其信号的变化可归因于两个过程：提取回收率的变化和基质效应。

提取回收率的变化是由提取效率变化造成的，而提取效率因样品而异；基质效应变化则由提取样品中基质成分不同而导致。


为了在早期生物分析方法开发过程中消除基质效应，必须对基质效应进行评估。本节介绍的内容主要集中在基质效应的单独评估上。


不过，标准曲线斜率法及其简化版可同时评估提取回收率和基质效应。其他评估基质效应的有用工具，如磷脂监测也将同时介绍。


提取后加标法
Postextraction spike method


提取后加标法被广泛用于定量评估基质效应。在生物分析方法的验证过程中，该方法通常用于评估绝对和/或相对基质效应。
评估绝对基质效应的方法是：将纯溶液中的分析物响应与空白基质（由样本经过前处理得到）中分析物响应进行比较。


（笔者注：即比较两者响应


a.分析物溶解在纯溶液中的响应;


b.分析物溶解在空白基质中的响应）


绝对基质效应是方法开发中的一个有用工具，可用于确定信号的变化是由基质效应引起的，还是由不同的提取回收率引起的。


不过，相对基质效应的信息量更大，因为它评估的是提取后加标到不同基质批次（通常是六到十个不同的基质批次）中分析物响应的变化。


相对基质效应变化大（不同基质批次之间的相对标准偏差 > 15%），表明不同批次的基质效应各不相同，可能会严重影响不同受试者生物分析检测的精密度和准确度。


另一方面，给定的检测可能会导致高绝对基质效应（即纯溶液和空白基质中分析物的响应差异很大），但相对基质效应却很低（即使用不同基质溶解分析物，其分析物响应变化极小）。在这种特定情况下，不同批次基质中抑制剂的提取回收率相近（即不同批次基质中抑制剂的浓度相近）。


柱后灌注法
Postcolumn infusion method


柱后灌注法是一种评估色谱运行过程中基质效应的程序，由 Bonfiglio 等人首次提出。这种定性方法是方法开发过程中的有力工具。


在 LC-MS/MS 色谱图上无法直接观察到共洗脱化合物的基质效应，因为它们是非挥发性化合物，或者因为没有监测到它们的离子对。柱后灌注法可在色谱图上描绘出发生电离抑制或增强的区域。


实验设计是通过安装在色谱柱和质量分析器之间的"三通（T型混合器）"，由注射泵向 LC-MS/MS 系统输送恒量的分析物（图 1），而液相系统则正常进样（样本为空白基质/流动相溶剂）并进行等度或梯度分离，即可获得分析物的电离曲线（图 2）。通过比较空白基质样本和流动相溶剂的电离曲线，可以评估该方法的基质效应。


图 1.柱后灌注法装置


基质效应与分析物有关，因此必须对所有分析物进行柱后灌注实验。事实上，两种洗脱时间不同的分析物会产生不同的基质效应，这取决于抑制和/或增强区域在色谱图中的位置。



图 2.将空白基质样品（血浆经蛋白沉淀）样品注入色谱柱并在柱后注入各分析物的色谱图。


如图 2 所示，细线和粗线分别表示：使用空白流动相/空白基质作为样本进行梯度分离，并采用柱后灌注时，分析物的响应比较。可以发现，两者的变化趋势并不一致（尽管注射泵注射了相同量的分析物）。这是因为：从色谱柱洗脱出来的血浆样本提取物会对分析物产生基质效应。A、B 和 C 代表了不同的分析物。A) Merck compound, (B) phenacetin and (C) caffeine


标准曲线斜率法
Standard-line slope method


标准曲线斜率法是一种定量方法，可同时评估提取效率和基质效应，但为简便起见，一般称为基质效应评估法。为了评估基质效应，通常会使用五个不同的基质批次配制五条标准曲线，并确定每个基质批次的标准曲线斜率。


不同批次基质的斜率变化可用于确认基质效应的存在，并评估其对生物分析方法的精密度和准确度的影响。当五个斜率之差超过 3~4% 时，基质效应被认为是显著的，因此可能会影响生物分析方法的精度和准确度。


该方法的简化版是提取六至十个不同批次的基质，分别以低浓度和高浓度的质控品进行加标，以评估分析物响应的精密度和准确度，并将它们放在一起进行比较，以验证不同批次基质之间的差异。


反向计算的浓度应符合质控品的验证标准，批间差也应在验证标准范围内。正如 2007 年 AAPS/ FDA 研讨会后发布的白皮书所述，间差（%CV）过高（如 15%或以上）表明存在明显的基质效应。在生物分析方法验证和方法开发过程中，通常使用简化版标准曲线斜率法来评估基质效应。

磷脂监测
Phospholipid monitoring


据报道，磷脂是血浆和其他生物样品中基质效应的主要原因之一。因此，在方法开发过程中对磷脂进行监测有助于研究基质效应。正离子模式监测磷脂的典型离子对（表 1）是最常用的磷脂监测方法。源内碰撞诱导解离（IS-CID）技术是另一种监测磷脂的方法。这种方法基于磷脂极性基团碎裂得到的普通离子（图 3）。


表 1.在方法开发过程中用于监测磷脂的典型离子对。



[td]  

磷脂	离子对
溶血磷脂酰胆碱 16:0	496/184
溶血磷脂酰胆碱 18:0	524/184
磷脂酰胆碱 30:1	704/184
磷脂酰胆碱 34:2	758/184
磷脂酰胆碱 36:2	786/184
磷脂酰胆碱 38:6	806/184

事实上，在三重四极杆质谱仪的碰撞池使用高能量来诱导普通离子（乙基磷酸三甲基铵离子；m/z184 或 m/z104）的解离。此外，第一（Q1）和第三（Q3）四极杆设置在相同的质荷比（184/184）处，并为第二四极杆选择了较低的碰撞能量，以避免进一步的碎片化。

图 3.磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱。图中标出了磷脂极性基团碎裂后得到的常见离子（乙基磷酸三甲基铵离子；m/z 184 或 m/z 104）。

根据最近的一项研究，该技术的局限性在于它只能监测磷脂酰胆碱（PC）、溶血磷脂酰胆碱（LPC）、缩醛磷脂和鞘磷脂（SM）磷脂。因此，Xia 和 Jemal建议采用一种不同的技术对所有磷脂进行定性评估，即所谓的“全包”技术。

事实上，该技术可监测所有类别的磷脂，包括 LPC、PC、磷脂酰乙醇胺 (PE)、磷脂酸(PA)、磷脂酰甘油 (PG)、磷脂酰肌醇 (PI) 和磷脂酰丝氨酸 (PS)。该技术在正模式下监测前体离子 m/z 184 和中性丢失 m/z 141，在负模式下监测前体离子 m/z 153。因此，“全包”技术可通过正离子和负离子模式一次进样检测所有类别的磷脂。

值得注意的是，磷脂的监测可以提供有关磷脂保留时间的宝贵信息，但在生物分析方法开发过程中，它不能用于直接评估所有基质效应，因为磷脂并不是生物提取物中基质效应的唯一来源。

此外，提取物中磷脂的存在并不总是会自动导致基质效应，因为这还取决于磷脂的浓度和相关分析物（基质效应取决于分析物）。

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原文来源：Côté, C.; Bergeron, A.; Mess, J.-N.; Furtado, M.; Garofolo, F. MatrixEffect Elimination during LC–MS/MS Bioanalytical Method Development. Bioanalysis2009, 1 (7), 1243–1257. https://doi.org/10.4155/bio.09.117.